Souhrn:
Metoda stanovení intracelulárních proteinů pomocí průtokové cytometrie umožňuje hodnocení
produkce různých cytokinů jasně definovanou buňkou (typ subpopulace, stav aktivace buňky).
K tomu, aby se metoda mohla stát rutinně používaným funkčním testem, je potřeba ji standardizovat.
To bylo cílem naší práce, kdy jsme podle literárních údajů našli všechny sporné body
a ty jsme experimentálně řešili. Zcela jednoznačně lze doporučit pouze natrium heparin jako
antikoagulační činidlo při vyšetřování plné krve. Práce řeší problémy s výběrem mitogenů, kdy
ukazujeme výrazný vliv použití mitogenů na výsledek a nutnost porovnávat výsledky získané pouze
za zcela stejných podmínek. Dále jsme testovali možnosti uchování krve před zpracováním a výběr
vhodných kombinací povrchových znaků a cytokinů. Při hledání optimální doby kultivace je třeba
provést kompromis mezi co nejvyšší možnou produkcí cytokinů (kinetika produkce různých cytokinů
je navíc odlišná) a přesností měření, protože detekce molekuly CD4 je po delší době stimulace
výrazně horší. Jako optimální navrhujeme 4,5hodinovou kultivaci s phorbol myristat acetátem.
Naše výsledky jasně prokazují mnohem vyšší schopnost zadržet nově tvořené cytokiny v buňce,
používáme-li brefeldinAnamísto monensinu. Výsledkempráce je standardní protokolpro stanovení
intracelulárních cytokinů.
Klíčová slova:
intracelulární cytokiny – mitogeny – inhibitory transportu proteinů.
|